Une variante commune de l'aldéhyde déshydrogénase 2 * 2 d'Asie de l'Est favorise l'arythmie ventriculaire avec la lumière chronique

Jun 21, 2023

Communications Biology volume 6, Article number: 610 (2023) Citer cet article

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Une forte consommation chronique d'alcool est associée à des arythmies mortelles. On ne sait pas si le déficit commun en aldéhyde déshydrogénase spécifique à l'Asie de l'Est (ALDH2 * 2) contribue à l'arythmogenèse causée par une faible consommation d'alcool. Ici, nous montrons que 59 consommateurs d'alcool habituels porteurs d'ALDH2 rs671 ont un intervalle QT plus long (corrigé) et des événements de tachyarythmie ventriculaire plus élevés par rapport à 137 consommateurs d'alcool habituels de type sauvage ALDH2 (Wt) et 57 non-consommateurs d'alcool. Notamment, nous observons un allongement de l'intervalle QT et un risque plus élevé de contractions ventriculaires prématurées chez les variants humains de l'ALDH2 présentant une consommation habituelle d'alcool légère à modérée. Nous récapitulons un phénotype d'allongement électrophysiologique de l'intervalle QT humain à l'aide d'un modèle de souris ALDH2 * 2 knock-in (KI) traité avec 4% d'éthanol, qui montre une quantité totale nettement réduite de connexine43 bien qu'une latéralisation accrue accompagnée d'un sarcolemme Nav1.5, Kv1.4 nettement régulé à la baisse et les expressions de Kv4.2 par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH. Les patch-clamps de cellules entières révèlent une prolongation du potentiel d'action plus prononcée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH. Par stimulation électrique programmée, les rotors ne peuvent être provoqués que chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH avec un nombre et une durée plus élevés d'épisodes d'arythmie ventriculaire. La présente recherche aide à formuler des lignes directrices sur la consommation sécuritaire d'alcool pour la population déficiente en ALDH2 et à développer de nouveaux agents protecteurs pour ces sujets.

Malgré le lourd fardeau imposé par les maladies cardiovasculaires et les décès annuels sous-estimés chez les gros buveurs d'alcool et les alcooliques1, la dose sûre exacte pour la consommation d'alcool reste incertaine et varie géographiquement2,3. L'association entre consommation d'alcool et mortalité cardiovasculaire semble suivre une courbe en J3. Une récente étude épidémiologique multiethnique à grande échelle a montré que les niveaux de consommation d'alcool que l'on croyait auparavant relativement inoffensifs étaient associés à un risque plus élevé de décès prématuré4. Des données expérimentales antérieures et des modèles de simulation ont établi un lien entre les effets arythmogènes liés à l'alcool et l'exposition aiguë à de fortes doses d'alcool (concentration d'alcool dans le sang> 20 mM) ou à une consommation excessive d'alcool chronique (≥ 6 verres / jour). L'instabilité électrophysiologique induite par l'exposition à l'alcool, dans les conditions indiquées ci-dessus, serait associée à une homéostasie dérégulée des canaux ioniques, à un potentiel d'action prolongé et à une excitation réentrante, qui entraînent tous une vulnérabilité accrue à l'arythmie ventriculaire (AV) et à la mort cardiaque subite5 ,6,7. Actuellement, le seuil toxique exact de la consommation chronique d'alcool et son lien mécaniste avec le développement de l'AV, une arythmie grave mais peu fréquente et potentiellement mortelle déclenchée par la consommation d'alcool, reste un sujet de controverse8,9.

L'aldéhyde déshydrogénase mitochondriale (ALDH2) joue un rôle central dans la désintoxication de l'éthanol et la cardioprotection contre les lésions d'ischémie-reperfusion10,11. La variante ALDH2 rs671, ou l'allèle ALDH2*2, qui code pour une enzyme ALDH2 inactive et provoque la réaction de bouffées vasomotrices à l'alcool, est l'une des enzymes les plus courantes et spécifiques à l'ethnie chez l'homme, affectant environ 540 millions d'Asiatiques de l'Est dans le monde12. La variante ALDH2 * 2 a récemment attiré beaucoup d'attention en raison de sa sensibilité accrue aux effets toxiques de l'alcool13,14. Une analyse épidémiologique récente portant sur les complications cardiovasculaires liées à la dose causées par la consommation d'alcool a indiqué que l'interprétation de ces relations peut être biaisée en raison d'un manque d'informations suffisantes sur le patrimoine génétique15. Nous avons précédemment démontré que la conduction électrique ventriculaire perturbée et la rentrée étaient des mécanismes putatifs de pro-arythmie dans des modèles animaux à forte consommation d'éthanol16. Nous avons supposé que des caractéristiques électrophysiologiques dérégulées et des mécanismes de rentrée peuvent provoquer une AV avec une dose d'alcool plus faible, telle que <2 verres standard/jour ou une consommation modérée, chez les humains présentant un déficit en ALDH2. Nous avons mené des études expérimentales mécanistes pour explorer la relation entre le déficit en ALDH2 et l'AV dans le cadre d'une exposition chronique faible à modérée à l'alcool à l'aide d'un modèle de souris ALDH2 * 2 knock-in (KI). Nous avons également mené une étude longitudinale clinique de 5 ans pour explorer cette relation et le risque d'arythmie parmi une cohorte de 196 sujets humains connus pour une consommation d'alcool légère à modérée ainsi que le génotype ALDH2 rs671.

Parmi les 196 adultes ayant une consommation habituelle d'alcool légère à modérée (médiane : 13,9 [7,6~29,3] g/jour, 1,2 [0,6~2,4] verre standard/jour), 59 (30,1 %) portaient l'allèle variant ALDH2 rs671 ( [ALDH2 Vt] ; G/A ou A/A), tandis que 137 (69,9 %) étaient de type sauvage ALDH2 ([ALDH2 Wt] ; G/G, tableau 1). Parmi les 57 non consommateurs d'alcool, 28 (49,1%) étaient ALDH2 Vt et 29 (50,9%) étaient ALDH2 Wt. Ces résultats ont indiqué que jusqu'à 70 % des participants à l'étude classés comme consommateurs habituels d'alcool étaient ALDH2 Wt (X2 p = 0,008), alors que parmi les non-consommateurs d'alcool, la répartition des porteurs de type sauvage et de la variante de l'ALDH2 était à peu près égale ( Tableau 1 ; Fig. 1b supplémentaire), qui se rapproche de la même distribution de génotype ALDH2 (51 % ALDH2 Wt) que celle trouvée dans la population taïwanaise générale et en bonne santé sur la base des données de Taiwan Biobank (https://taiwanview.twbiobank.org.tw). Dans l'ensemble, les consommateurs d'alcool habituels étaient plus susceptibles d'être des hommes, quel que soit le génotype ALDH2, et présentaient une prévalence plus élevée d'hypertension dans le groupe ALDH2 Wt. Les consommateurs habituels d'alcool (Alc+) ont démontré une durée de QRS et un QTc plus prolongés par rapport à leurs non-consommateurs d'alcool respectifs (Alc−) indépendamment des génotypes ALDH2 (les deux p <0,05) (Tableau 1 et Fig. 1a), avec des consommateurs habituels d'alcool (Alc+ ) portant ALDH2 Vt ont en outre montré un QTc significativement plus long que les consommateurs d'alcool ALDH2 Wt (Alc +) (Fig. 1a). Des modèles de régression multivariée à rebours ont montré qu'une dose plus élevée de consommation d'alcool (coefficient ajusté : 4,52 [IC 95 % : 3,14–5,91], pour 10 g+/jour, p < 0,001), ALDH2 Vt (coef ajusté : 7,67 [IC 95 % : IC : 2,15–13,18], p = 0,003), le sexe féminin, les antécédents d'hypertension, de coronaropathie et de diabète étaient indépendamment associés à un allongement de l'intervalle QTc (Fig. 1b). Notamment, les individus ALDH2 Vt ont montré une pente d'allongement QTc dose-dépendante plus élevée (r = 0,58) par rapport à celle des participants ALDH2 Wt (r = 0,31) à des doses quotidiennes plus importantes de consommation d'alcool (pinteraction ajustée : 0,017) (Fig. 1c ).

Les consommateurs d'alcool ALDH2 Vt ont montré un intervalle QT significativement plus long (corrigé en intervalle RR comme QTc) par rapport aux non-consommateurs d'alcool (Alc−) et aux consommateurs d'alcool ALDH2 Wt (430,1 vs 422,4 vs 415,6 ms dans Alc−, Alc+ ALDH2 Wt et Alc+ ALDH2 Vt, respectivement) (a). La boîte à moustaches représente les quartiles 25 et 75 %, la ligne représente la médiane et les moustaches représentent 10 % (inférieur) et 90 % (supérieur). * désigne p < 0,05 pour Alc+ par rapport à Alc− dans chaque groupe de génotypes (ALDH Wt ou ALDH Vt). Modèles de régression multivariée pas à pas en arrière explorant les associations entre les covariables cliniques et l'intervalle QTc dans l'étude actuelle (b). Des quantités quotidiennes d'alcool plus élevées étaient associées à des augmentations plus abruptes de l'intervalle QTc chez les sujets porteurs d'ALDH2 Vt (rose) par rapport à ALDH2 Wt (bleu) (pinteraction ajustée : 0,017) (c). Les barres en c représentent l'écart type pour QTc et l'erreur type pour la dose d'alcool, respectivement. Les zones ombrées représentent la zone de l'intervalle de confiance à 95 %. *p < 0,05, **p < 0,001 pour Alc+ versus Alc− dans chaque catégorie de génotype (ALDH Wt ou ALDH Vt) ; #p < 0,05 pour Alc+, ALDH Vt versus Alc+, ALDH Wt.

Des ECG de suivi en série et une étude Holter axée sur les symptômes ont été utilisés pour évaluer la fréquence clinique et la gravité des AV chez les participants à notre étude. Dix-sept participants à l'étude avec AV (~ 7%) ont été identifiés au cours d'une période de suivi de 5 ans. Aucun n'a été trouvé chez les non-consommateurs d'alcool parmi les participants, alors que 6 (4,4 %) ont été détectés chez les consommateurs d'alcool habituels ALDH2 Wt, les consommateurs d'alcool habituels porteurs d'ALDH2 Vt montrant un risque presque 4 fois plus élevé de développer des AV significatifs (n = 11 , 18,6 %) (X2 p < 0,001). Les modèles de régression logistique multivariée utilisés pour examiner les prédicteurs des AV sont affichés (tableau 2). En dehors d'antécédents connus de coronaropathie, les personnes porteuses d'ALDH2 Vt avaient un risque quatre fois plus élevé (odds ratio ajusté : 4,46, IC à 95 % : 1,50–13,23, ALDH2 Wt comme référence) de développer des épisodes d'AV. Une dose plus élevée de consommation d'alcool était indépendamment associée à un risque plus élevé d'AV significatifs (odds ratio ajusté : 1,41, IC à 95 % : 1,13–1,74, par tranche de 10 g/jour ; Tableau 2), le risque étant plus prononcé dans l'ALDH2 Vt porteurs (pinteraction ajustée : 0,038) ; (Tableau 2). La présence d'ALDH2 Vt (rs671) n'a pas affecté les antécédents de CAD en termes de développement d'AV (pinteraction ajustée : 0,30). Lorsque l'indice de Youden a été utilisé pour une estimation optimale du seuil, le seuil d'apport quotidien en éthanol pour les AV significatifs chez les participants à l'étude ALDH2 Vt et ALDH2 Wt était de 9,6 g/jour (0,7 verre/jour) et de 14,1 g/jour (1,0 verre/jour ), respectivement.

Le protocole expérimental est présenté (Fig. 2a). La concentration d'alcool dans le sang (BAC) chez les souris de type sauvage (Wt) et ALDH2 * 2 KI nourries avec un régime liquide normal et à 4% d'EtOH pendant 7 semaines a été déterminée (Fig. 2 supplémentaire). Les souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées avec un régime à 4% d'alcool pendant 7 semaines ont montré une légère augmentation de la morphologie brute de l'épaisseur de la paroi cardiaque et de la taille du cœur, par rapport aux groupes sans régime alcoolisé (Fig. 2b). Une fibrose interstitielle myocardique plus étendue a été observée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% par rapport à celle des souris Wt traitées à l'EtOH à 4% et d'autres groupes (Fig. 2c, d). Les souris ALDH2 * 2 KI nourries avec 4% d'EtOH ont également montré une augmentation significative du rapport poids cardiaque / poids corporel (HW / BW) par rapport à celui des souris Wt traitées à 4% EtOH et d'autres groupes (Fig. 2d). Les BAC étaient de 0,011 ± 0,001 vol% (2,120 ± 0,281 mM), 0,057 ± 0,007 vol% (9,443 ± 1,102 mM), 0,013 ± 0,002 vol% (2,098 ± 0,270 mM) et 0,068 ± 0,007 vol% (11,58 ± 1,171 millimètre ) pour les groupes de souris Wt / régime normal, Wt / 4% EtOH, ALDH2 * 2 KI / régime normal et ALDH2 * 2 KI / 4% EtOH (Fig. 2 supplémentaire). Notamment, le phénotype électrocardiographique des souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% a reproduit le phénotype humain montrant un allongement marqué des intervalles QT (QT et QTc) et l'apparition spontanée d'AV par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH à 4% et à d'autres groupes (2 souris sur 7 contre aucune dans les autres groupes de souris, Fig. 2e – g, j). Une tendance similaire sur la pente d'allongement QTc plus élevée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% par rapport à celle des souris Wt traitées à l'EtOH à 4% à des niveaux de BAC plus élevés (pinteraction: 0, 035) (Fig. 2k) a été observée.

Souris ALDH2 * 2 KI homozygotes âgées de quatre mois (C57BL / 6, mâle) après 7 semaines de traitement par un régime à 4% d'Alc ( a ). Résultats liés à la pathologie dans la morphologie brute représentative et les coupes transversales de cœurs de souris de différents groupes montrant une masse myocardique et une épaisseur de paroi LV préservées mais légèrement plus élevées chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH ( b ). Analyse histologique (H&E) avec coloration au trichrome de Masson (MT) des coupes cardiaques (c). Le poids du cœur indexé sur le poids corporel des souris a révélé une augmentation légère mais significative dans les groupes de souris traitées à l'EtOH à 4 % (à gauche), en particulier chez les souris ALDH2 * 2 KI, par rapport à celles de leurs groupes témoins de régime normal respectifs ( d ). Une fibrose nettement étendue (flèches noires) dans le myocarde (coloration bleu clair) a également été observée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH (à droite) ( d ). Illustrations de l'électrocardiogramme de surface corporelle (ECG) dans le modèle de souris. Les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% ont montré des phénotypes électrocardiographiques de durée QRS plus prolongée, d'intervalle QT ( e ) et d'apparition spontanée de VPC fréquents (flèche noire) ( f ) par rapport aux autres groupes pendant 5 min d'enregistrement ECG continu. En moyenne, QRS et QTc ont montré des augmentations de 16% et 23,6% par rapport aux souris Wt à régime normal chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH (les deux p <0, 05) par ECG de surface (g – j). Une pente de prolongation QTc plus élevée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% (rose) par rapport à celle des souris Wt traitées à l'EtOH à 4% (bleu) à des niveaux de BAC plus élevés (pinteraction: 0, 035) a été observée (Fig. 2k). Les zones ombrées représentent la zone de l'intervalle de confiance à 95 %. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pour tout contrôle EtOH à 4 % par rapport à un régime alimentaire normal dans chaque groupe de génotype (ALDH2*2 KI ou Wt) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 pour 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs 4 % EtOH Wt.

Ensuite, nous avons examiné la protéine de jonction lacunaire, Cx43, et plusieurs canaux/transporteurs ioniques clés impliqués dans la dépolarisation/repolarisation ventriculaire. La double coloration des tissus myocardiques avec l'anticorps Cx43 a révélé que Cx43 était régulé positivement chez les souris Wt traitées à l'EtOH à 4% par rapport aux souris Wt à régime normal (Fig. 3a, b). En revanche, Cx43 était significativement régulé à la baisse chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celles des souris Wt traitées à l'EtOH (réduction de 36, 6%, p = 0, 006. Figure 3b). La distribution de Cx43 dans les cardiomyocytes des deux souris traitées à l'EtOH a été altérée. Bien que la Cx43 soit principalement confinée aux disques intercalés chez les souris Wt à régime normal, un rapport plus élevé de marqueurs Cx43 a été observé sur les bords latéraux des cardiomyocytes dans les deux groupes de souris traitées à l'EtOH. Ces résultats ont indiqué une latéralisation accrue de Cx43 dans les groupes Wt et ALDH2 * 2 KI traités à l'EtOH par rapport à celle de leurs groupes témoins de régime normal respectifs, les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH présentant une latéralisation Cx43 plus prononcée par rapport à celle de l'EtOH- souris Wt traitées (augmentation de 52, 8% et 67, 2% des groupes de souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport aux souris Wt à régime normal, respectivement, les deux p <0, 001) (Fig. 3a, c).

La microscopie immuno-confocale pour la double coloration myocardique pour WGA et Cx43 a montré une zone d'expression totale de Cx43 significativement réduite (avec et sans correction totale de la zone myocardique) chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celle des Wt et du régime normal traités à l'EtOH Groupes de souris ALDH2 * 2 KI, avec une augmentation caractéristique de la coloration cytoplasmique Cx43 (flèches blanches) (a, b). Un rapport nettement accru de redistribution de Cx43 sur les bordures latérales des cardiomyocytes a été observé dans les deux groupes de souris traitées à l'EtOH par rapport à celui des deux autres groupes témoins à régime normal (a, c), les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH présentant des effets plus prononcés. augmentation de la latéralisation de Cx43 par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH. Pour chaque groupe, 13 à 15 images ont été analysées (3 souris dans chaque groupe) (×40, 800 pixels). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pour tout contrôle EtOH à 4 % par rapport à un régime alimentaire normal dans chaque groupe de génotype (ALDH2*2 KI ou Wt) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 pour 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs 4 % EtOH Wt.

L'analyse morphologique de diverses expressions de protéines de canaux ioniques parmi différents groupes de souris par microscopie par immunofluorescence est illustrée dans la Fig. 3 supplémentaire. Les cardiomyocytes ventriculaires ont été colorés pour Nav1.5 (vert), Cav1.2 (vert), Cav1.3 (vert), Kv1.4 (vert), Kv4.2 (vert), Kv4.3 (vert) et WGA (rouge), ainsi que la coloration DAPI (bleu). En bref, la microscopie par immunofluorescence a indiqué que, par rapport aux souris Wt à régime normal, les cardiomyocytes des deux souris traitées à l'EtOH présentaient des altérations morphologiques et un remodelage des canaux ioniques, ainsi que des schémas de striation architecturaux anormaux des cardiomyocytes, qui étaient plus importants chez les souris ALDH2 * 2 KI. Ceux-ci peuvent inclure une coloration désorganisée de Nav1.5 (tête de flèche blanche), une coloration atténuée et une perte de striation de Kv1.4 (tête de flèche blanche et astérisque marqué), des agrégations irrégulières et une coloration atténuée de Kv4.2 (tête de flèche blanche et astérisque marqué), accentué coloration de Kv4.3 (pointe de flèche blanche) et à la fois Cav1.2 et Cav1.3 accentués bien que l'agrégation altérée dans Cav1.2 (pointe de flèche blanche).

Nous avons effectué des expériences quantitatives de transfert Western pour quantifier l'expression des protéines (Fig. 4a – q). Le transfert Western de préparations de tissus entiers a montré une régulation positive du TGF-β1 et du collagène-1 dans le myocarde des souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH. Encore une fois, le TGF-β1 et le collagène-1 étaient exprimés de manière plus importante dans les cœurs de souris ALDH2 * 2 KI traités à l'EtOH (Fig. 4b, c). L'expression de la protéine totale Cx43 était significativement régulée à la baisse dans ALDH2 * 2 KI traité à l'EtOH par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH et aux autres groupes (tous p <0, 05) (Fig. 4d). En revanche, l'expression de la protéine totale Cx43 chez les souris Wt traitées à l'EtOH était régulée à la hausse par rapport à celle des souris Wt traitées avec un régime normal. Les niveaux d'expression des canaux ioniques impliqués dans la dépolarisation et la repolarisation ventriculaires étaient reflétés par l'expression totale de l'expression de Nav1.5 qui était légèrement régulée à la hausse chez les souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celle de leurs groupes témoins de régime normal respectifs (p = 0,034 et 0,028, respectivement) (Fig. 4e). Kv1.4 et Kv4.2 ont été considérablement régulés négativement chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celles des groupes de souris témoins ALDH2 * 2 KI à régime normal (p = 0,029 et 0,039, respectivement), avec une expression de Kv4.2 significativement plus faible. observé chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celui des souris Wt traitées à l'EtOH. Ces différences n'étaient pas significatives chez les souris Wt traitées à l'EtOH par rapport aux souris Wt à régime normal (p = 0, 71 et 0, 93) (Fig. 4f, g). Kv4.3 était considérablement régulé à la hausse chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celles des souris Wt traitées à l'EtOH et d'autres groupes (Fig. 4h). Cav1.3 de type L était significativement régulé à la hausse chez les souris Wt traitées à l'EtOH par rapport au groupe de souris Wt à régime normal (p = 0, 044), bien qu'aucune différence significative pour Cav1.2 n'ait été trouvée entre les groupes (Fig. 4i, j). L'échangeur sodium-calcium (NCX) et CaMKII (expression totale et leurs formes phosphorylées / oxydées) ont été régulés positivement dans EtOH traité par rapport à ceux de leurs groupes témoins de régime normal respectifs, quels que soient les génotypes, CaMKII étant la protéine la plus régulée positivement dans EtOH -souris ALDH2 * 2 KI traitées (Fig. 4 supplémentaire).

Analyse densitométrique du tissu cardiaque TGF‐β1/collagène-1, Cx43 (forme totale) et une variété de protéines de canaux ioniques (y compris Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 et Cav1 .3) de quatre groupes de souris (a–q) via western blot. Par rapport aux souris Wt à régime normal, les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH ont montré une réduction de 40,4% du Cx43 total, une réduction de 74,3% du Kv1.4 et une réduction de 67,2% du Kv4.2 (d, f, g), respectivement . Les fractions cytoplasmiques et membranaires des niveaux d'expression des canaux ioniques (k – q) ont été examinées séparément pour déterminer la distribution subcellulaire de leurs altérations chez des souris fonctionnant distinctement ALDH2 nourries avec un régime EtOH normal ou à 4%. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pour tout contrôle EtOH à 4 % par rapport à un régime alimentaire normal dans chaque groupe de génotype (ALDH2*2 KI ou Wt) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 pour 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs 4 % EtOH Wt.

Comme la fraction membranaire des canaux ioniques reste le composant fonctionnel fondamental de la génération d'impulsions électriques et de potentiel d'action, nous avons examiné plus en détail les niveaux d'expression des protéines myocardiques de la fraction membranaire, séparément de ceux de la fraction cytoplasmique (Fig. 4k – q). Nous avons observé des expressions de Nav1.5 distinctement régulées chez des souris traitées à l'EtOH. Le sarcolemme Nav1.5 était nettement régulé à la baisse chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celui des souris Wt traitées à l'EtOH (p < 0,001) ; en revanche, le traitement à l'EtOH a entraîné une régulation positive de Nav1.5 du sarcolemme chez les souris Wt par rapport aux souris Wt à régime normal (p = 0, 008) (Fig. 4l). Les deux sarcolemmes Kv1.4 et Kv4.2 ont montré une régulation négative marquée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celles de leurs groupes respectifs de souris Wt traitées à l'EtOH (les deux p <0, 05, respectivement) (Fig. 4m, n). Inversement, le Kv4.3 membranaire chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH était significativement régulé à la hausse par rapport à celui des souris Wt traitées à l'EtOH et d'autres groupes (Fig. 4o). Les canaux calciques de type L de Cav1.2 et Cav1.3 dans la fraction membranaire étaient significativement régulés positivement chez les souris Wt traitées à l'EtOH par rapport à leurs souris témoins Wt à régime normal, bien que ces différences n'aient pas été observées dans les groupes de souris ALDH2 * 2 KI. Enfin, des régulations à la hausse significatives de Cav1.3 cytoplasmique mais pas de Cav1.2 ont été observées dans les deux groupes de souris traitées à l'EtOH par rapport à celles de leurs témoins de régime normaux respectifs, quels que soient les génotypes (Fig. 4p, q).

Les changements dynamiques de la durée du potentiel d'action (APD) et de la vitesse de conduction (CV) ont été analysés pour évaluer les effets de l'alcool sur les schémas de propagation électrique cardiaque des souris WT et ALDH2*2 KI. Le potentiel de membrane dans la surface épicardique du ventricule gauche évalué via un enregistrement optique à une longueur de cycle de stimulation (PCL) de 300 ms est illustré (Fig. 5a). L'APD70 moyenne était systématiquement plus longue chez les souris traitées à l'EtOH par rapport à celles de leurs groupes témoins de régime normal respectifs, quels que soient les génotypes, avec une APD70 globale significativement plus élevée observée chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celle des souris Wt traitées à l'EtOH ( figure 5b). Il n'y avait pas de différences significatives entre les CV des quatre groupes différents à une PCL de 200 ms. Malgré une augmentation significative des CV chez les souris traitées à l'EtOH par rapport à celles des souris Wt à régime normal, nous avons observé que les CV étaient considérablement réduits chez les souris traitées à l'EtOH par rapport à ceux des souris ALDH2 * 2 KI à régime normal à des PCL de 250 et 300 ms. Les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH ont en outre montré des CV significativement inférieurs à ceux des souris Wt traitées à l'EtOH à des PCL de 250 et 300 ms (Fig. 5c, d). Ces résultats ont indiqué que les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH présentaient une APD significativement prolongée et des CV inférieurs à des PCL plus élevés.

a Potentiel d'action optique à 300 ms PCL. b APD à 70 % de repolarisation. c Un exemple de propagation électrique sous forme de cartes isochrones dans le ventricule à 300 ms PCL. d CV à différents PCL ; n = 6 dans chaque groupe ; les barres d'erreur sont SD ; Les valeurs p ont été calculées à l'aide de GraphPad Prism 8.0 avec plusieurs tests t. Durée du potentiel d'action APD, vitesse de conduction CV, durée du cycle de stimulation PCL. e Des enregistrements ECG simultanés et une cartographie optique ventriculaire ont été effectués pendant l'induction d'AV à partir d'un exemple d'AV malin chez des souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH. Les souris Wt traitées à l'EtOH n'ont montré qu'un seul épisode d'AV avec une légère rupture d'onde et n'ont pas présenté de rotations pendant l'AV (Fig. 2 supplémentaire, Film supplémentaire 2). Les souris Wt et ALDH2 * 2 KI nourries avec un régime alimentaire normal ont révélé une propagation électrique fluide après l'induction du PES (films supplémentaires 3 et 4). f Points de fréquence dominante (DF) et instantanés de l'onde en spirale correspondant au signal optique dans le domaine temporel à un point donné pendant VA avec g plusieurs battements VA et sites d'initiation affichés (flèches blanches). h, i Quantification des épisodes AV induits et durée. (n = 6 dans chaque groupe). Les barres d'erreur représentent l'écart type ; Les valeurs p ont été calculées via des tests t de Student non appariés à l'aide de GraphPad Prism 8.0. Arythmie ventriculaire VA, stimulation électrique programmée PES, fréquence dominante DF.

La sensibilité des souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à l'arythmie a été testée plus avant via une stimulation programmée. Au cours de l'induction de l'AV, une vulnérabilité élevée des AV malins ainsi qu'une activité réentrante inductible à haute fréquence ont été observées chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH après PES (11 épisodes / 6 souris dans l'ALDH2 * 2 KI traité à l'EtOH vs 0–1 épisode / 6 souris dans d'autres groupes, toutes p <0, 05) (Fig. 5e – i; Figs. supplémentaires 5, 6). À l'aide d'une carte de fréquence dominante, des zones à haute fréquence de rotations VA et de rotors méandreux inductibles avec de multiples ondelettes désorganisées ont été observées chez 4 des 6 souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH pendant les battements VA, mais pas dans d'autres groupes (Fig. 5f, g ; Fig. supplémentaires 5, 6 ; Film supplémentaire 1). En comparaison, une seule souris Wt traitée à l'EtOH a montré des fronts d'onde d'activation anormaux avec des VA inductibles (Fig. 6b supplémentaire; Film supplémentaire 2), et aucune des souris du régime normal Wt ou du groupe ALDH2 * 2 KI du régime normal n'a montré VA inductible (Figs. Supplémentaires 6a, c; Films Supplémentaires 3, 4). Les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH présentaient un nombre et une durée d'épisodes VA significativement plus élevés que ceux des souris Wt traitées à l'EtOH (Fig. 5h, i). Ces résultats ont démontré que les épisodes VA accrus ainsi que les durées VA récapitulaient les principales caractéristiques pro-arythmogènes chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH.

Pour déterminer si l'APD des souris ALDH2 * 2 KI traitées avec EtOH est altérée, les cardiomyocytes isolés ont été surveillés à l'aide de la technique du patch clamp. Les cardiomyocytes ont été stimulés par des stimuli dépolarisants supraliminaires de 5 ms en mode pince de courant. L'APD (à 50 % et 90 % de repolarisation) a été prolongée dans les cardiomyocytes des souris Wt et ALDH2*2 KI traitées à l'EtOH. Des APD significativement plus longues ont été enregistrées à APD50 ainsi qu'à APD90 dans des cardiomyocytes isolés de souris traitées à l'EtOH par rapport à ceux de leurs groupes témoins de régime normal respectifs, quels que soient les génotypes, les cardiomyocytes ALDH2 * 2 KI traités à l'EtOH présentant des APD significativement plus longs que ceux des souris Wt traitées à l'EtOH (toutes p <0, 05) (Fig. 6a, b). Cela a indiqué que la prolongation de l'APD a également étayé nos conclusions concernant le potentiel de membrane de cartographie optique morphologique (Fig. 6a). Le courant de dépolarisation principal à la course AP ascendante (Vmax) des cardiomyocytes, Nav1.5 dysfonctionnel peut agir pour réduire l'influx de Na+, ralentir la propagation des impulsions et héberger l'hétérogénéité de la conduction17,18. Dans la présente étude, la Vmax dans les cardiomyocytes isolés des deux souris traitées à l'EtOH était considérablement diminuée par rapport à celles de leur régime alimentaire normal respectif, quels que soient les génotypes (125,9 ± 6,3 contre 146,9 ± 9,6 9 mV/s pour les souris Wt, p = 0,04 97,6 ± 8,0 contre 140,4 ± 13,9 mV/s pour les souris ALDH2*2 KI, p < 0,01), les cardiomyocytes ALDH2*2 traités à l'EtOH présentant en outre une Vmax significativement inférieure à celle des souris Wt traitées à l'EtOH (p < 0,01, figure 6c). Il n'y avait aucune différence significative entre le potentiel de membrane au repos et l'amplitude du potentiel d'action des cardiomyocytes isolés de tous les groupes (Fig. 6d).

Comparaisons d'enregistrements superposés d'APD à 50 % et 90 % de repolarisation (a, b), Vmax (c), potentiel de membrane au repos (RMP) et amplitude du potentiel d'action (APA) d parmi différents groupes de souris. Vmax était de 97,6 ± 8,0 contre 140,4 ± 13,9 mV/s pour les souris ALDH2*2 KI traitées à l'EtOH et à régime normal, respectivement ; et 125,9 ± 6,3 contre 146,9 ± 9,6 ± 9 mV/s pour les souris Wt traitées à l'EtOH et à régime normal, respectivement. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pour tout contrôle EtOH à 4 % par rapport à un régime alimentaire normal dans chaque groupe de génotype (ALDH2*2 KI ou Wt) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 pour 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs 4 % EtOH Wt. n = 8 cellules indépendantes dans chaque groupe. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard.

Pour élucider les mécanismes sous-jacents à la réduction du potentiel d'action Vmax dans les cardiomyocytes de souris traités à l'alcool avec ou sans mutation ALDH2, nous avons comparé le courant sodique des cardiomyocytes (INa) entre différents groupes (Fig. 7a – d). INa a été déclenché par une étape de dépolarisation de 50 ms de -80 mV à +30 mV avec un incrément de 5 mV à partir d'un potentiel de maintien de -80 mV. Des traces représentatives et des relations courant-tension ont montré que l'INa dans les cardiomyocytes isolés des deux groupes de souris traitées à l'EtOH était nettement diminuée, en particulier chez celles dérivées des souris traitées à l'EtOH par rapport à celle de leurs groupes témoins de régime normal respectifs (-54,28 ± 5,69 vs -66,87 ± 8,09 pA/pF à -45 mV pour les souris Wt, p < 0,05 ; -32,23 ± 4,42 vs -66,50 ± 7,93 pA/pF à -45 mV pour les souris ALDH2*2 KI, p < 0,001) (Fig 7b–d). La cinétique de INa affectée chez des souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH à 4% a été analysée à l'aide d'une courbe d'inactivation de INa. Différents niveaux de tension de pré-impulsions de conditionnement (-120 à 30 mV) ont été appliqués pendant 200 ms pour induire l'inactivation du canal, afin d'examiner l'inactivation de INa dépendant de la tension. Une deuxième impulsion (-30 mV) a ensuite été utilisée pour dépolariser le potentiel de membrane pendant 50 ms (Fig. 7a supplémentaire). L'amplitude de INa a ensuite été normalisée à l'amplitude maximale du courant (Fig. 7b supplémentaire) et les traces ont été ajustées à l'aide du modèle d'équation de Boltzmann (Fig. 7c supplémentaire). Les résultats ont montré que la courbe d'inactivation de l'INa dans les cardiomyocytes des souris ALDH2*2 KI traitées avec 4 % d'EtOH était sensiblement décalée vers la gauche avec une pente plus raide et V0,5 observé par rapport à l'alimentation normale des souris ALDH2*2 KI ou des souris Wt traitées à l'EtOH. souris (les deux p <0, 01, respectivement), indiquant une cinétique INa diversement affectée. Cependant, les souris Wt traitées à l'EtOH n'ont montré qu'un léger décalage, mais non significatif, de la courbe d'inactivation des cardiomyocytes par rapport aux souris Wt à régime normal (Fig. 7d supplémentaire). D'autre part, la récupération de INa à partir de l'inactivation a été déterminée à l'aide d'un protocole typique d'impulsions appariées. Après un potentiel de maintien de -80 mV, 2 impulsions identiques de -30 mV pendant 30 ms ont été séparées dans chaque intervalle (0 à 380 ms) (Fig. 7e supplémentaire). Les courants par rapport aux intervalles entre les impulsions appariées ont été générés et tracés (Fig. 7f supplémentaire) et les traces ont été ajustées par une seule équation exponentielle (Fig. 7g supplémentaire).

INa et ICa ont été obtenus via une étape de dépolarisation de 50 (a) et 400 ms (e), respectivement, avec des traces représentatives (b, f pour INa et ICa) et des relations courant-tension montrant la densité INa et ICa (c, g) parmi différents groupes de souris. Densité INa nettement diminuée des cardiomyocytes dans les deux groupes de souris traitées à l'EtOH à -45 mV (avec le courant maximal) par rapport à leurs témoins de régime normaux respectifs, quels que soient les génotypes et les souris Wt traitées à l'EtOH ( d ). À 0 mV, les densités d'ICa des cardiomyocytes dans les deux groupes de souris traitées à l'EtOH étaient significativement plus faibles, en particulier chez les souris ALDH2 * 2 KI, par rapport à celles de leurs groupes témoins de régime normal respectifs (h). Les détails sur les courbes d'inactivation INa/ICa dépendantes de la tension et la récupération de INa/ICa à partir de l'inactivation parmi différents groupes de souris sont détaillés plus en détail dans les Figs supplémentaires. 3 et 4. Le courant de potassium total sortant (IK) (i), les traces représentatives et les relations courant-tension montrant la densité de courant de potassium sortant transitoire (Ito) parmi différents groupes de souris. L'Ito a été défini comme la différence entre le courant de crête (Ipeak) et le courant de régime permanent (Iss) (j). Les densités Ipeak, Iss et Ito (k) ont diminué de manière significative dans les cardiomyocytes des deux groupes de souris traitées à l'EtOH. La densité Ipeak et Ito des cardiomyocytes était significativement plus faible uniquement dans les groupes traités à l'EtOH par rapport à leurs groupes témoins de régime normal respectifs de génotype ALDH2 * 2 KI. Ces comparaisons n'étaient pas significatives dans les groupes de souris Wt (l). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 pour tout contrôle EtOH à 4 % par rapport à un régime alimentaire normal dans chaque groupe de génotype (ALDH2*2 KI ou Wt) ; #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 pour 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs 4 % EtOH Wt. n = 10 cellules indépendantes dans chaque groupe. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard.

Les deux groupes traités à l'EtOH ont montré un décalage significatif vers la droite avec une constante de temps accrue (τ) dans les courbes de récupération après inactivation par rapport à celles de leurs groupes témoins de régime normal respectifs (p = 0,01 et p <0,01 pour Wt et ALDH2 * 2 groupes de souris KI, respectivement), indiquant une cinétique AP diversement modifiée (Fig. 7h supplémentaire). Dans l'ensemble, les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH ont montré une réduction plus significative du courant sodique des cardiomyocytes (INa) et une prolongation de la constante de temps de récupération (τ) dans les courbes de récupération après l'inactivation par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH (Fig. 7b – d; Fig supplémentaire . 7). Nous avons en outre étudié le rôle des courants calciques (ICa) dans l'APD et comparé l'ICa des cardiomyocytes de différents groupes de souris (Fig. 7e – h). ICa a été déclenché par une impulsion dépolarisante de 400 ms de -38 à +60 mV avec un incrément de 2 mV à partir d'un potentiel de maintien de -40 mV. La densité d'ICa dans les cardiomyocytes des deux souris traitées à l'EtOH était diminuée par rapport à celle de leur contrôle alimentaire normal respectif (−6,72 ± 1,28 vs −8,48 ± 0,5 pA/pF à 0 mV pour les souris Wt, p < 0,05 ; −4,41 ± 0,54 contre −7,75 ± 0,55 pA/pF à 0 mV pour les souris ALDH2*2 KI, p < 0,001) (Fig. 7f – h), encore une fois, les cardiomyocytes isolés des souris ALDH2*2 KI traitées à l'EtOH montrant le plus diminution prononcée de leur densité ICa. Le traitement à l'alcool à 4 % a également déplacé la courbe de récupération en fonction du temps vers la droite et a ralenti la récupération de l'ICa à partir de l'inactivation. Pour examiner l'inactivation de l'ICa dépendant de la tension, différents niveaux de tension de pré-impulsions de conditionnement (-40 à 10 mV) ont été appliqués pendant 200 ms pour induire l'inactivation du canal. Une deuxième impulsion (0 mV) a ensuite été appliquée pendant 100 ms pour dépolariser le potentiel de membrane (Fig. 8a supplémentaire). L'amplitude de ICa a ensuite été normalisée à l'amplitude maximale du courant (Fig. 8b supplémentaire) et les traces ont été ajustées à l'aide du modèle d'équation de Boltzmann Fig. 8c supplémentaire). Aucun changement significatif n'a été observé entre les courbes d'inactivation de l'ICa des cardiomyocytes de tous les groupes de souris (Fig. 8d supplémentaire). D'autre part, la récupération d'ICa à partir de l'inactivation a été déterminée à l'aide d'un protocole typique d'impulsions appariées. Après avoir maintenu un potentiel de -40 mV, deux impulsions identiques de 0 mV d'une durée de 200 ms ont été appliquées avec des intervalles de 0 à 85 ms entre elles (Fig. 8e supplémentaire). Les courants par rapport aux intervalles entre les impulsions appariées ont été tracés (Fig. 8f supplémentaire) et les traces ont été ajustées via une seule équation exponentielle (Fig. 8g supplémentaire). La constante de temps (τ) a été significativement augmentée dans les cardiomyocytes des deux souris traitées à l'EtOH par rapport à celle de leurs groupes témoins de régime normal respectifs, quels que soient les génotypes (τ; les deux p <0, 01; Fig. 8h supplémentaire), indiquant que la repolarisation de l'ICa la cinétique a été significativement perturbée en raison du traitement à l'alcool.

Pour clarifier l'association entre le courant de potassium sortant transitoire (Ito) et la prolongation de l'APD dans les cardiomyocytes de souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'alcool, nous avons comparé l'Ito de cardiomyocytes de différents groupes en mode voltage-clamp (Fig. 7i– l). Le courant de potassium sortant total (IK) a été déclenché via une dépolarisation de 5 ms à -40 mV, suivie d'une impulsion dépolarisante de 400 ms de -30 mV à +80 mV, avec un incrément de 5 mV à partir d'un potentiel de maintien de -70 mV . Ito a été défini comme la différence entre le courant de crête (Ipeak) et le courant de régime permanent (Iss) (Fig. 7j). Les relations courant-tension ont montré que Ipeak, Iss et Ito dans les cardiomyocytes des souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH étaient significativement plus faibles que les souris Wt à régime normal (Fig. 7k). À + 80 mV, les densités Ipeak et Ito des cardiomyocytes des souris traitées à l'EtOH étaient significativement inférieures à celles de leurs groupes témoins de régime normal de génotype ALDH2 * 2 KI (réduction de 23% et 32%, respectivement), mais pas significativement différent entre les groupes de souris traitées à l'EtOH et de souris à régime normal de génotype Wt (Ipeak et Ito : 27,68 ± 3,18 vs 35,87 ± 2,26 pA/pF et 10,77 ± 1,77 vs 15,83 ± 1,33 pA/pF pour le KI traité à l'EtOH vs le KI de régime normal , les deux p < 0,05 ; 31,79 ± 3,11 contre 47,52 ± 7,25 pA/pF et 12,45 ± 1,81 contre 17,87 ± 3,33 pA/pF pour Wt traité à l'EtOH vs Wt avec un régime normal, p = 0,08 et 0,15, respectivement ; Fig. 7l ). La densité Iss des cardiomyocytes des deux souris traitées à l'EtOH était comparable à celle de leur témoin de régime normal respectif, quels que soient les génotypes (Fig. 7l). Ni l'inactivation d'Ito (Fig. Supplémentaire 9a – d) ni la récupération (Fig. Supplémentaire 9e-h) d'Ito des cardiomyocytes ne différaient entre les différents groupes. Le courant de potassium du redresseur entrant (IK1) était comparable entre les quatre groupes, ce qui confirme la conclusion selon laquelle la RMP était similaire dans tous les groupes (Fig. 10 supplémentaire). Pris collectivement, notre cartographie optique et notre simulation imitant l'AV humain, ainsi que les résultats des mesures de patch-clamp des potentiels d'action unicellulaires ont indiqué que le génotype ALDH2 * 2 KI était le composant caractéristique associé à l'AV chez les humains engagés dans la lumière-à- consommation modérée d'alcool.

Il a été proposé que le seuil de l'effet toxique de l'alcool soit significativement plus bas chez les sujets humains porteurs du variant ALDH2*219. Une réduction du seuil de sécurité de l'alcool a un impact sur la santé, impliquant des implications cliniques pour environ 540 millions d'habitants, soit près de 35 à 45 % de la population mondiale d'Asie de l'Est10,12,13,14. Nous rapportons ici que les durées de QTc (ALDH2 rs671 G/A ou A/A) ont été significativement prolongées chez les sujets humains consommateurs d'alcool légers à modérés (dose médiane : 12,7 [IQR : 6,3 ~ 32,8] g/jour, ou verre médian standard : 0,9 [IQR : 0,5~2,3] verres/jour ; 1 verre standard américain = 14 g d'alcool pur) porteurs de génotypes variants ALDH2, par rapport aux consommateurs habituels d'alcool porteurs du génotype sauvage ALDH2 et aux non-consommateurs d'alcool3, 4. En utilisant des souris ALDH2 * 2 KI auxquelles on a administré un régime à 4% d'alcool pendant 7 semaines, nous avons récapitulé le phénotype électrocardiographique humain de l'allongement de l'intervalle QT avec vulnérabilité VA. La vulnérabilité à l'AV a été exclusivement observée chez des souris vivantes ALDH2 * 2 KI nourries à l'alcool et provoquée ex vivo dans des cœurs perfusés de Langendorff dérivés de souris ALDH2 * 2 KI nourries à l'alcool via une stimulation électrique programmée. L'induction de l'AV chez les souris ALDH2 * 2 KI nourries avec une faible dose d'alcool semble reposer sur le dépôt de collagène myocardique pathologiquement provoqué, ainsi que sur le remodelage distinctif de Cx43 et de Nav1.5 sarcolemmique affectant la dépolarisation. Des mécanismes ioniques repolarisants altérés (par exemple, réduction de la densité d'Ito) observés à partir de cardiomyocytes patch-clamps unicellulaires et une signalisation CaMKII anormale ont encore aggravé l'APD prolongée avec une sensibilité accrue à l'AV chez les souris ALDH2 * 2 KI nourries à l'alcool.

Il a été démontré qu'une exposition aiguë et excessive à l'alcool déclenche plusieurs cascades de signalisation pathologiques conduisant à des arythmies5,20,21. Bien qu'il ait été démontré qu'une forte consommation d'alcool chronique provoque des arythmies potentiellement mortelles, il n'est pas clair si le déficit en enzyme ALDH2 contribue à des caractéristiques électrophysiologiques défavorables à un seuil de sécurité inférieur par rapport à ceux sans déficit en ALDH2. Sur la base d'une période d'observation de 5 ans qui a été menée dans le cadre de la présente étude, nous avons constaté que le niveau seuil reliant l'exposition quotidienne à l'éthanol au risque de développer des AV cliniques était inférieur à 1,0 verre standard par jour (9,6 g/jour ou 0,7 verres/jour) pour les humains porteurs de variants ALDH2 par rapport aux sujets humains ALDH2 normaux (14,1 g/jour ou 1 verre/jour). Cette découverte suggère que les porteurs inactifs de l'enzyme ALDH2 consommant des niveaux légers à modérés de boissons alcoolisées peuvent être confrontés à des événements AV potentiellement mortels. De plus, les personnes porteuses de la forme inactive d'ALDH2 étaient plus susceptibles de connaître des résultats extrêmement défavorables en raison de la susceptibilité à l'AV. Conformément à ces résultats, l'étude actuelle a indiqué que les épisodes d'AV à haut risque ainsi que la formation de rotors par cartographie optique (Fig. 5h, i) n'étaient inductibles que chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées avec un régime incorporant 4% EtOH, une dose ce qui est légèrement inférieur à un régime incorporant la dose modérée acceptée d'alcool de 5 % d'EtOH, rapportée par une autre étude22. Par rapport aux souris Wt nourries avec un régime EtOH à 6% en continu pendant 14 semaines, ce qui a démontré des perturbations électrophysiologiques importantes dans une étude précédente, les souris Wt nourries avec un régime EtOH à 4% pendant 14 semaines continues n'ont montré que des effets électrophysiologiques ventriculaires modestes sans VA16 provocable. Notamment, le taux d'alcoolémie de 40 à 50 mg / dL (8 à 12 mM) chez nos souris Wt traitées à l'EtOH à 4% correspondait à la dose modeste chez l'homme23 et à l'exposition légère à modérée à l'alcool dans les modèles expérimentaux de souris C57BL / 624. Cette concentration d'alcool était également considérée comme une faible dose (2 à 20 mM) en ce qui concerne les effets nerveux centraux liés à l'alcool23. Dans une autre étude, l'effet aigu de l'allongement de l'APD dans les cardiomyocytes ventriculaires humains à l'aide d'un modèle de simulation n'a été observé qu'à une concentration élevée d'éthanol de 80 mM25, alors que l'allongement de l'APD dans les cardiomyocytes de souris dérivés d'ALDH2*2 a été observé à un seuil inférieur de 12 mM. l'éthanol.

Les résultats de la présente étude ont indiqué que Cx43 était régulé positivement chez des souris Wt traitées à l'EtOH à 4 % pendant 7 semaines. Cependant, nous avons observé que Cx43 était significativement régulé à la baisse chez les souris Wt avec un traitement EtOH à 4 % pendant 14 semaines continues dans nos travaux précédents16 et chez les souris ALDH2*2 KI traitées à l'EtOH pendant seulement 7 semaines dans la présente étude, ce qui indiquait peut-être que Un déficit en ALDH2 accélérerait l'anomalie Cx43 avec la même dose d'exposition à l'éthanol. Comme indiqué dans une de nos études précédentes, la Cx43 était régulée positivement chez des souris C57BL/6 J de type sauvage ayant reçu 36 % d'alcool comme seule source de liquide potable26. Néanmoins, les groupes de souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH présentaient une latéralisation améliorée de Cx43 (Fig. 3c), ce qui favorisait probablement la formation d'hémicanaux non jonctionnels et facilitait les fuites de courant avec une dynamique Ca2 + améliorée. Ces caractéristiques de remodelage arythmogène de la Cx43 combinées à une fibrose interstitielle provoquée, ont encore altéré le couplage cellule à cellule et ont partiellement contribué à la propagation dispersée des impulsions conduisant à un ralentissement du CV et à la rentrée favorisée avec des effets pro-arythmiques17,29,30. Un remodelage modeste de Cx43 en conjonction avec des facteurs influençant la conduction électrique (par exemple, Vmax réduit) peut également être arythmogène. De plus, la régulation à la baisse de Nav1.5 (ou INa) avec une phase 0 plus lente peut également contribuer à l'allongement de l'APD17,18. Par conséquent, nous avons examiné plus en détail INa chez des souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH en utilisant un patch-clamping de cardiomyocytes unicellulaires isolés29. Une de nos études précédentes a montré que l'administration d'EtOH à 4 % pendant 14 semaines exerçait des effets modestes, tels qu'une réduction du sarcolemme Nav1.5 (~ 30 %) et un dysfonctionnement, sur des souris C57BL/6 WT16. En comparaison, la réduction de Nav1.5 et INa membranaires était plus prononcée chez les souris ALDH2 * 2 KI par rapport aux souris Wt traitées à l'EtOH traitées avec 4% EtOH pendant 7 semaines, bien que les souris Wt et ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH aient montré Vmax diminué et influx de Na + altéré avec des propriétés de déclenchement anormales partagées par rapport à leurs contrôles de régime normaux respectifs dans notre étude de patch-clamp. De plus, comme le potentiel de membrane au repos et IK1 peuvent influencer Vmax et INa, des valeurs comparables de ces tests (Fig. 6d et Fig. 10 supplémentaires) ont indiqué que la réduction observée de Vmax et la diminution de INa peuvent être attribuables à une régulation négative excessive de Nav1. 5 (comme observé chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH) ou au dysfonctionnement interne de Nav1.5. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent également que Cx43 et Nav1.5 dérégulés chez les souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH ont entraîné une perte plus profonde de réserve de conduction pendant la dépolarisation, fournissant ainsi des substrats électrophysiologiques qui favorisent l'initiation de la formation de circuits réentrants et VA épisodes.

Les protéines du canal ionique Kv, en particulier Ito, peuvent jouer un rôle central dans la détermination de l'APD des cardiomyocytes, car le courant potassique du redresseur entrant (IK1) était comparable entre les différents groupes de souris de notre étude29,31. Notamment, Kv1.4 et Kv4.2 jouent un rôle essentiel en tant que canaux ioniques responsables de la repolarisation ventriculaire chez la souris, Kv4.2 servant de protéine de canal ionique Kv ventriculaire dominante32,33,34. Par conséquent, l'expression de Kv4.2 régulée à la baisse a entraîné une baisse de Ito,f et une prolongation de APD35. Dans la présente étude, les deux sarcolemmes Kv1.4/Kv4.2 ont été nettement réduits chez les souris ALDH2*2 KI traitées à l'EtOH par rapport à celles de leurs souris Wt traitées à l'EtOH respectives, indiquant un dysfonctionnement critique dans Ito et les processus de repolarisation d'ALDH2. carence enzymatique exposée à EtOH qui peut faciliter la formation de substrat d'arythmie. En revanche, Kv4.3, un canal Ito,f fonctionnel mineur chez la souris, semble avoir été nettement régulé chez nos souris ALDH2 * 2 KI traitées à l'EtOH pour compenser le Kv4.2 supprimé ou l'Ito diminué, comme indiqué dans d'autres études33 ,36. Le Kv4.3 régulé à la hausse est également connu pour contrecarrer les conséquences des VA mortels induits par la dispersion électrique de la CaMKII hyper-activée et de la signalisation en aval avec une tentative d'inverser le remodelage électrique/structurel ventriculaire dans certaines conditions cardiaques pathologiques37,38,39. Néanmoins, une homéostasie Ca2+ défectueuse due à la surexpression de CaMKII causée par un traitement à l'alcool chez des souris ALDH2*2 KI active probablement la signalisation en aval dépendante de CaMKII (par exemple, l'activation de l'échangeur sodium-calcium)40 en générant un courant dépolarisant vers l'intérieur qui contribue davantage à l'allongement de l'AP41, 42. En accord avec les découvertes précédentes qui indiquent que l'acétaldéhyde accumulé peut inhiber l'ICa, par le biais de plusieurs mécanismes, par exemple, l'homéostasie intracellulaire perturbée du Ca2+ en favorisant directement la fuite de Ca2+ médiée par RyR2 et l'inhibition de RyR2, la phosphorylation perturbée du Ca2+ ou la fuite de Ca2+ médiée par SERCA de Activation de CAMKII, limitant ainsi la quantité de Ca2+ libérée du réticulum sarcoplasmique lors de la stimulation. Nous avons donc émis l'hypothèse que de tels effets pourraient également être possibles et aggravés dans les conditions ALDH2*2 KI21,43,44,45. La courbe d'activation ICa plus lente et décalée vers la droite (Fig. 7g), associée à une constante de temps de récupération (τ) plus lente après l'inactivation (Fig. 8 supplémentaire), peut prédisposer les cardiomyocytes à l'allongement de l'AP, augmentant ainsi la propension aux arythmies. Considérées ensemble, ces caractéristiques agissent probablement simultanément et de manière synergique pour favoriser la formation de substrats et de rotors arythmogènes repolarisants avec une plus grande vulnérabilité des AV lors de la stimulation programmée chez des souris ALDH2 * 2 KI traitées avec 4% EtOH46. De futures études sont nécessaires pour démontrer si ces mécanismes et perturbations électriques sont les causes sous-jacentes de la susceptibilité accrue des sujets humains porteurs d'ALDH2 * 2 qui se livrent à une consommation chronique d'alcool légère à modérée, aux arythmies.

En résumé, nos résultats comblent le manque de connaissances actuel concernant les seuils de sécurité de l'alcool nécessaires pour prévenir les AV chez les sujets humains porteurs de Wt ALDH2 et ceux porteurs de la variante inactive ALDH2 * 2 intolérante à l'alcool. À notre connaissance, il s'agit également de la première étude à fournir des données complètes sur les propriétés électrophysiologiques ventriculaires des porteurs de variantes Wt ALDH2 et ALDH2 * 2 qui sont exposés de manière chronique à des niveaux d'alcool allant de légers à modestes. Nous avons démontré que l'allongement de l'APD phénotypique lié aux AV chez des sujets humains connus pour être porteurs de la variante ALDH2 * 2 ainsi qu'une consommation d'alcool légère à modeste, a pleinement étayé les résultats de nos études animales utilisant des souris ALDH2 * 2 KI traitées avec une faible consommation correspondante. dose d'alcool. Des études mécanistes ont montré des substrats de rentrée ventriculaire avec formation de rotor par cartographie optique. Au niveau moléculaire, une large gamme de canaux ioniques et de remodelage des connexines s'est avérée entraîner des courants de dépolarisation / repolarisation dysfonctionnels, entraînant une sensibilité accrue aux AV (Fig. 8). Ces résultats indiquent que le génotype ALDH2 * 2 est le composant sensible de l'AV chez les humains ayant une consommation d'alcool légère à modérée et soulignent le risque d'AV létaux induits par une consommation d'alcool faible à modérée. L'interprétation des résultats de l'étude actuelle doit être prudente car notre modèle expérimental de souris a été traité avec un régime à 4% d'alcool comme seule source de nourriture, ce qui peut varier du schéma et de la fréquence de consommation d'alcool chez l'homme. Étant donné que l'ALDH2 * 2 affecte une grande population mondiale composée de 540 millions d'Asiatiques de l'Est, dont beaucoup sont des buveurs d'alcool légers à modérés, nos résultats pourraient justifier une confirmation par d'autres études épidémiologiques à grande échelle à l'avenir. Les variantes asiatiques faux-sens ALDH2, autres que la variante ALDH2 * 2, ont récemment été compilées par la base de données d'agrégation du génome humain (gnomAD, https://gnomad.broadinstitute.org/)47. Plusieurs de ces variants ALDH2 ont montré une activité réduite de métabolisation de l'alcool in vitro47. Il est probable que les porteurs de telles variantes ALDH2 dans d'autres groupes ethniques puissent également devenir vulnérables aux événements VA via la consommation d'alcool léger à modéré. De même, nos travaux récents ont également montré que les variantes ALDH2 sont sujettes au développement de la fibrillation auriculaire et à une altération de la fonction auriculaire avec une consommation d'alcool légère à modérée48. Par conséquent, il est de plus en plus nécessaire que les décideurs en matière de santé publique évaluent et formulent des directives sur la consommation d'alcool en toute sécurité pour un large segment de la population atteinte d'un déficit en ALDH2. Des activateurs enzymatiques à petites molécules d'ALDH2*2, comme Alda-1, ont été découverts11. D'un point de vue préventif, de tels composés peuvent servir d'agents protecteurs pour les sujets porteurs du variant ALDH2*2, consommateurs fréquents d'alcool ou dépendants à l'alcool.

Modifications des propriétés électrophysiologiques cardiaques dans des conditions de (1) type sauvage (Wt) sans utilisation d'EtOH (panneau de gauche), (2) Wt avec utilisation d'EtOH (panneau du milieu) et (3) variante ALDH2 (polymorphisme) avec utilisation d'EtOH ( panneau de droite).

Nous avons recruté de manière prospective 268 participants à l'étude dans nos cliniques externes via un questionnaire structuré concernant la consommation habituelle d'alcool. Le génotypage ALDH2 SNP rs671 a été réalisé chez 260 participants à l'étude, dont 256 ont rempli des informations démographiques cliniques, après une sélection basée sur des critères d'exclusion (Fig. 1a supplémentaire). Nous avons recueilli des résultats d'ECG de surface corporelle à 12 dérivations, des données anthropométriques (telles que la taille, le poids et le tour de taille), des informations biochimiques (y compris les profils lipidiques et la fonction rénale définie comme eGFR à l'aide de la formule MDRD) et des antécédents médicaux, y compris la présence de l'hypertension, du diabète de type 2, du traitement de l'hyperlipidémie, de la coronaropathie et des médicaments associés utilisés par tous les participants. Tous nos participants à l'étude n'avaient pas d'insuffisance cardiaque et n'avaient aucune condition médicale urgente. Le consentement éclairé a été obtenu de tous les participants à l'étude. Ces participants ont été suivis pendant au moins cinq ans concernant la consommation d'alcool. Nos questionnaires et enquêtes ont indiqué que leur mode de consommation d'alcool était stable depuis au moins 5 ans. La dose quotidienne de consommation d'alcool a été estimée à l'aide d'un questionnaire structuré dans lequel différents types de boissons alcoolisées consommées ainsi que les quantités et la fréquence d'utilisation ont été autodéclarés49. En bref, les participants à l'étude ont été invités à indiquer à quelle fréquence ils consommaient de la bière, de l'alcool, du vin et du vin fort, ainsi que la quantité consommée à chaque occasion. La consommation hebdomadaire d'alcool pour chaque participant a été calculée en grammes d'alcool pur en multipliant le produit de la fréquence de chaque boisson alcoolisée consommée et la dose exacte d'éthanol (dérivée de la quantité et de la concentration d'éthanol [c'est-à-dire 3,5 à 4,5 % pour la bière], par la gravité spécifique de l'éthanol (0,79 g/ml) dans chaque type de boisson alcoolisée) comme suit :

Les participants à l'étude ont été classés en tant que non-consommateurs d'alcool (définis comme ceux qui n'ont pas consommé de boissons alcoolisées ou ceux qui ont consommé <14 g d'alcool (égal à 1 verre standard) sur une base hebdomadaire) et les consommateurs habituels d'alcool (ceux qui ont consommé > 1 verre standard/semaine). Afin de se concentrer sur les sujets humains avec une consommation d'alcool légère à modérée, 3 (qui ont été classés comme gros buveurs d'alcool (consommation d'alcool ≥ 90 g/jour ou 6,4 verres/jour) des 256 participants initiaux à l'étude ont été exclus. a abouti à un total de 253 participants à l'étude, dont 196 usttracks habituels d'alcool léger à modéré, entrant dans notre analyse finale et notre suivi (Fig. S1A).Ces 196 consommateurs habituels d'alcool léger à modéré et 57 non-consommateurs d'alcool ont été classés en deux groupes en fonction de leurs génotypes ALDH2 comme suit : ALDH2*1 de type sauvage (Wt) ; et la variante ALDH2 (génotype ALDH2 GA ou AA) (ALDH2 Vt) (Tableau 1). Cette étude a été approuvée par le Comité d'examen institutionnel. de l'hôpital MacKay Memorial (14MMHIS069) et s'est conformé à la Déclaration d'Helsinki.Les ensembles de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Chaque participant à l'étude a reçu un enregistrement ECG de surface corporelle standardisé à 12 dérivations (Page Writer Trim III ; Philips, Andover, MA, États-Unis). Les paramètres relatifs à l'intervalle PR, à la durée QRS et aux intervalles QT (avec et sans correction de l'intervalle RR : QTc) ont été obtenus et analysés automatiquement via un logiciel avec la vitesse du papier réglée à 50 mm/s, ce qui a permis d'obtenir des indices QRSd et QT précis et fiables. mesures.

Des ECG de base et en série ont été effectués annuellement ou suivis deux fois par an dans des cliniques externes pendant une période allant jusqu'à 5 ans. De plus, la surveillance Holter (pendant 24 heures continues) a été organisée en fonction du jugement clinique des cardiologues et des symptômes cliniques (c'est-à-dire palpitations, étourdissements ou gêne thoracique) ou des signes (par exemple, arythmies suspectées) des participants à l'étude. Les AV cliniques ont été définies comme > 1 contraction ventriculaire prématurée sur un seul enregistrement ECG de 10 secondes ou > 30 contractions ventriculaires prématurées en une heure (moyenne par enregistrement sur 24 heures) au départ ou pendant le suivi (jusqu'à 5 ans), ce qui serait associée à un taux plus élevé de mort cardiaque subite50.

L'étude animale ALDH2 * 2 KI s'est conformée aux directives institutionnelles et nationales pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (Taiwan Animal Protection Law; Scientific Application of Animals, 1998). Tous les animaux utilisés dans cette étude (souris ALDH2 * 2 homozygotes et leurs compagnons de portée de type sauvage) avaient un fond génétique C57BL / 6, et les protocoles ont été examinés par le conseil institutionnel (MMH-AS-107-69). Des souris mâles C57BL/6 de type sauvage âgées de quatre mois ou des souris ALDH2*2 KI homozygotes ont été réparties en deux groupes de régime16. Ceux-ci étaient, (i) le groupe de régime normal (régime liquide ad libitum; mélange sec #F1259SP Bio-Serv® Advancing Science. Enriching Animals, USA Test avec de l'eau chaude du robinet); et (ii) le groupe EtOH à 4 % (régime liquide à base d'alcool à 4 % v/v ; mélange sec #F1697SP, Bio-Serv® additionné de maltose-dextrine, d'éthanol et d'eau chaude du robinet). Le régime liquide est resté la seule source de liquide et de nourriture à laquelle les souris avaient accès pendant 7 semaines consécutives. Au total, notre étude comprenait quatre groupes de souris : (i) poids/alimentation normale, (ii) poids/EtOH à 4 %, (iii) ALDH2*2 KI/alimentation normale et (iv) ALDH2*2 KI/4 % EtOH. Dans le groupe à régime normal, le maltose-dextrine a été remplacé de manière isocalorique par de l'éthanol. Une heure après l'alimentation, toutes les souris ont été euthanasiées sous anesthésie profonde et du sang veineux a été prélevé et prélevé de la queue (0,1 à 0,2 ml). Des échantillons de sérum ont été prélevés et centrifugés, et le plasma a été conservé à -80 °C. Les BAC ont été déterminés à l'aide d'un kit de dosage d'éthanol EnzyChrom™ (ECET-100, BioAssay Systems). Le protocole expérimental a été approuvé par le comité de protection et d'utilisation des animaux du comité d'examen institutionnel de l'hôpital MacKay Memorial. Les souris ont été euthanasiées par anesthésie à l'isoflurane avec perfusion transcardiale de solution saline. Un schéma de l'étude de la souris est montré (Fig. 1).

Un ECG de surface corporelle a été réalisé sous anesthésie en utilisant 1 à 2% d'isoflurane (FORANE, ABBOTT Laboratories Ltd., Angleterre) dans une combinaison d'oxygène et de protoxyde d'azote mélangé à de l'air dans un rapport de 50:50. Après stabilisation, nos souris expérimentales ont été soumises à des examens ECG détaillés de la surface corporelle (à une fréquence cardiaque d'environ 450 à 550 battements/min) avec des électrodes connectées à un système de surveillance Biopac (Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, USA). L'ECG de surface corporelle a été réalisé à l'aide d'électrodes ECG insérées par voie sous-cutanée dans les quatre membres, et des enregistrements ECG séquentiels ont été acquis à une vitesse de balayage de 2 kHz pendant 10 min. Les résultats ECG pour les souris ont été stockés sous forme de données brutes et enregistrés au départ (16 semaines) et au point final de l'étude (23 semaines) avant le sacrifice. Les données ont été stockées pour une analyse hors ligne à l'aide de scripts MATLAB personnalisés 2 analysés à l'aide d'un logiciel commercialisé (Biopac Student Lab Analysis 4.1.0) couvrant 30 à 35 battements de cœur. L'intervalle PR a été mesuré du début de l'onde P au pic de l'onde R. L'intervalle QRS a été mesuré depuis le début de l'onde Q jusqu'au point auquel l'onde S a franchi le point de référence. L'intervalle QT a été mesuré depuis le début de l'onde Q jusqu'au moment où l'onde T a décliné à 90 % (T90) à partir du pic. Les valeurs QT corrigées de la fréquence cardiaque adaptative ont été dérivées en utilisant une modification de la formule de Mitchell pour l'ECG murin comme :

Afin d'analyser la morphologie et les modèles de remodelage du Cx43 myocardique, le Cx43 immunomarqué d'échantillons myocardiques a été imagé et examiné par microscopie confocale à balayage laser à l'aide d'un Leica TCS SP équipé d'un laser argon/krypton. Le remodelage morphologique et structurel de diverses protéines de canaux ioniques, notamment Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 et Cav1.3, a été examiné par microscopie par immunofluorescence. Les cœurs de souris ont d'abord été perfusés avec une solution saline normale. Tous les échantillons ventriculaires ont ensuite été intégrés dans une solution OCT et stockés à -80 ° C. Le tissu congelé a été coupé en sections de 3 µm et fixé avec 4 % de paraformaldéhyde, perméabilisé avec 0,5 % de Triton X-100 pendant 30 min, puis bloqué dans une solution de blocage (0,1 % d'albumine de sérum bovin et 0,1 % de Triton X-100 dans du phosphate de Dulbecco- solution saline tamponnée) pendant une heure. Une double coloration de l'agglutinine de germe de blé et de la connexine 43 a également été réalisée pour la détection du remodelage cardiaque. Le WGA conjugué au FITC (Vector, Burlingame, CA, USA) a été utilisé pour détecter les bordures cellulaires. Un anticorps anti-Cx43 (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) a été utilisé pour détecter Cx43. L'anti-lapin Cy3 d'âne (Chemicon, Californie, États-Unis) a été utilisé pour visualiser la connexine 43 immunomarquée (Cx43).

Pour le double marquage des canaux ioniques et WGA, Nav1.5 (1:200, lapin polyclonal, Alomone Labs), Cav1.2 (1:100, lapin polyclonal, Alomone Labs), Cav1.3 (1:100, lapin polyclonal, Alomone Labs), Kv1.4 (1:100, polyclone de lapin, Alomone Labs), Kv4.2 (1:100, polyclone de lapin, Alomone Labs) et Kv4.3 (1:100, polyclone de lapin, Alomone Labs) ont été incubé pendant une nuit à 4 ° C, suivi d'un marquage avec chèvre-anti-lapin Alexa 488 (1: 400, Invitrogen). Et le lendemain, les conjugués WGA avec Alexa 594 (1:500, Invitrogen) ont été incubés pendant 2 heures à 25 °C. Toutes les sections ont été montées avec un anti-fade contenant du DAPI.

Les images ont été collectées à l'aide d'un objectif 40 × et d'un zoom 1,0 pour la coloration Cx4.3/WGA ; zoom 4.0 pour la coloration du canal ionique/WGA du réglage de l'ordinateur. Chaque image enregistrée était composée de 1024 × 1024 pixels. Des vues en projection de quatre sections optiques consécutives ont été prises à des intervalles de 0,25 ou 1 μm au milieu des sections et enregistrées pour analyse. Toutes les images ont été traitées avec le logiciel ImageJ ou Adobe Photoshop CS6.

L'analyse d'image de Cx43 a été réalisée à l'aide du logiciel d'analyse d'image QWIN (Leica) pour l'analyse de la distribution myocardique de Cx43, et les informations et évaluations suivantes ont été obtenues de chaque groupe de souris, y compris (i) la surface totale de Cx43 immunomarqué (par tranche d'image), ( ii) la surface totale de Cx43 immunomarquée par zone de cardiomyocytes, et (iii) le pourcentage de surface de Cx43 immunomarquée le long des bordures latérales divisée par la surface totale de protéines Cx43 immunomarquées dans des cardiomyocytes individuels.

Western blot de préparations de tissus entiers d'échantillons de tissus myocardiques pour la Cx43 (y compris les isoformes totales, phosphorylées [fonctionnelles] [p-Cx43] et non phosphorylées [np-Cx43] de Cx43), la protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline ( CaMKII, à la fois les formes totales et oxydées [ox-CaMKII]), les canaux ioniques et les protéines de transport d'ions pertinentes responsables de la génération du potentiel d'action ont été menées à l'aide d'anticorps appropriés. Les fractions cytoplasmiques et membraneuses des canaux ioniques clés ou des protéines associées aux propriétés électrophysiologiques ont été testées plus avant. Des échantillons de tissus de la paroi libre ventriculaire gauche (sous forme de préparations de tissus entiers) à partir d'azote liquide ont été lysés à l'aide d'un tampon de lyse cellulaire NP40 à 1%, contenant un comprimé cocktail inhibiteur de phosphatase (Roche) et un comprimé cocktail inhibiteur de protéase (Roche), et homogénéisé par sonication . Les protéines cytoplasmiques et membranaires de la paroi libre du ventricule gauche ont été préparées à l'aide d'un kit d'extraction de protéines à compartiment CNM (K3012010, BioChain, USA). La protéine totale a été estimée en utilisant la méthode de Lowry (DC Protein Assay Kit, Bio-Rad, USA).

L'électrophorèse sur gel de SDS-polyacrylamide a été réalisée à l'aide de mini-gels constitués de 5% de gels d'empilement et de 10 à 12% de gels de séparation. Ensuite, 30 à 40 µg de chaque protéine tissulaire, 100 µg de fraction cytoplasmique ou 50 µg de fraction membranaire ont été mélangés avec un tampon d'échantillon (2,5 % de 2-mercaptoéthanol et 1 % de bleu de bromophénol) pour produire un volume final de 20 à 30 µL, chargé dans chaque voie, soumis à une électrophorèse (80 V pour le fonctionnement en gel d'empilement et 120 V en gel de séparation ; tension constante) et transféré (80 V, tension constante pendant 150 min sur glace). La membrane PVDF (Perkin Elmer, USA) a été détectée à l'aide d'anticorps primaires spécifiques de Collagen-1 (1:1000, monoclonal de souris, Sigma), Cx43 (1:250, monoclone de souris, BD Biosciences), Cx43 (1:1000, polyclone de lapin , Sigma-Aldrich) pour reconnaître la forme phosphorylée (fonctionnelle) (p-Cx43) et les isoformes non phosphorylées (np-Cx43 [Cx43-P0]) de Cx43. TGF-bêta 1 (1:500, monoclone de souris, Santa Cruz), Nav1.5 (1:200, clone polyclonal de lapin, Alomone Labs), Kv1.4 (1:200, clone polyclonal de lapin, Alomone Labs), Kv4. 2 (1:200, lapin polyclone, Alomone Labs), Kv4.3 (1:200, lapin polyclone, Alomone labs), Cav1.2 (1:250, lapin polyclone, Alomone Labs), Cav1.3 (1:250 , monoclone de souris, Gene Tex), NCX1 (1:1000, monoclone de souris, Gene Tex), p (Thr286)- Calcium/calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII) (1:2000, monoclonal de souris, Gene Tex), ox -CaMKII (1:1000, clone polyclonal de lapin, Gene Tex) et CaMKII total (1:1000, clone polyclonal de lapin, Gene Tex) à 4°C pendant la nuit. Les transferts ont ensuite été incubés avec des anticorps secondaires pendant 1 h à température ambiante. L'immunoréactivité a été visualisée à l'aide d'une solution ECL (Perkin Elmer, USA) pour développer les images. Pour normaliser les niveaux d'expression, les transferts ont été dépouillés et incubés avec un anticorps anti-GAPDH (1:50 000, monoclonal de souris, Sigma-Aldrich), qui a été utilisé comme contrôle interne. Pour normaliser les niveaux d'expression des protéines membranaires, nous avons utilisé la protéine marqueur membranaire Na + K + - ATPase (1: 1000, Rabbit polyclonal, Cell Signaling) comme contrôle interne. Pour le transfert Western, un balayage et une analyse densitométriques quantitatifs ont été effectués sur les transferts en utilisant le système d'image MultiGel-21 (TOPBIO CO. Taiwan) pour développer des images et le logiciel Gel-Pro pour l'analyse. Des versions originales non recadrées de ces analyses étaient disponibles dans les Figs supplémentaires. 11–15.

Les souris ont été euthanasiées sous anesthésie pour la cartographie ex vivo de VA. Les cœurs ont été immédiatement excisés par thoracotomie et perfusés à Langendorff avec une solution de Tyrode oxygénée chaude (pH 7,4 ; 95 % d'O2, 5 % de CO2, 36 à 38 °C). Une électrode Ag/AgCl a été placée sur le LV près de l'apex, tandis qu'une autre a été attachée à la surface du ventricule droit pour enregistrer l'ECG. Le cœur de souris isolé a été coloré avec un colorant sensible à la tension (Di-4-ANEPPS, 100 μmol/L, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour enregistrer les potentiels de membrane optique après 10 min de stabilisation. La blebbistatin (5–10 μmol, TOCRIS, Bristol, UK) a été directement ajoutée à la solution de Tyrode pour réduire les artefacts de mouvement. Les cœurs ont été uniformément éclairés avec une diode électroluminescente verte à une longueur d'onde de 505 ± 20 nm pour activer Di-4-ANEPPS. Les images de fluorescence ont été capturées à travers un filtre passe-long de 600 nm à l'aide d'une caméra CMOS (1000 images/seconde, SciMedia, USA). La vulnérabilité à l'AV induite par la stimulation a été évaluée via une stimulation électrique programmée à travers dix cycles de stimulation en rafale (20 Hz, 10 s) qui était deux fois le seuil d'excitation du ventricule gauche pour chaque souris. La fréquence dominante des signaux optiques pendant l'AV induite à chaque emplacement de la zone cartographiée a été enregistrée et calculée à l'aide de la transformée de Fourier rapide. Une carte de fréquence dominante a été construite en utilisant la fréquence dominante de tous les pixels.

La technique de patch-clamp de cellules entières a été utilisée pour enregistrer le potentiel de membrane et les courants ioniques avec un amplificateur Axon CNS 700 B (Molecular Devices, CA, USA), un système d'acquisition de données Digidata 1550 A et le logiciel pClamp (Version 10, Molecular Devices) dans modes de serrage de courant et de tension. Les myocytes ventriculaires gauches ont été isolés par voie enzymatique en utilisant la technique de perfusion cardiaque de Langendorff. Des coeurs de souris ont été rétrogradement perfusés avec du tampon Krebs (120 mM NaCl, 12 mM glucose, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 1,2 MgSO4 et 5,4 KCl. Après équilibrage, 0,4 mg/mL de collagénase (type II, Worthington) dans du tampon Krebs a été perfusé pour 20 min Des cœurs de souris ont été coupés en petits morceaux et filtrés dans du milieu Eagle modifié de Dulbecco (Invitrogen, Gibco).

Les cellules quiescentes ont été placées dans une chambre montée sur la platine d'un microscope inversé (Eclipse Ti-U, Nikon Corporation, Japon) dans une solution de bain contenant 137, 5,4, 1,8, 1,1, 6, 22 et 0,33 mM de NaCl, KCl , CaCl2, MgCl2, HEPES, glucose et NaH2PO4, respectivement. Le pH a été ajusté à 7,4 à l'aide de NaOH. Pour les expériences visant à détecter INa, la N-méthyl-D-glucamine (91 mM) a été utilisée pour remplacer des concentrations égales de NaCl. Dans des expériences spécifiques, du Cs+ (2 mM) et du Co2+ (1 mM) ont été ajoutés pour bloquer les courants de potassium et de calcium, respectivement. Des électrodes en verre polies à la chaleur (résistances de pointe d'environ 2 MΩ lorsqu'elles sont remplies d'une solution interne à travers une pipette) ont été préparées à partir de capillaires en verre borosilicaté (diamètre extérieur 1,5 mm) à l'aide d'un extracteur de microélectrodes en verre (PC-10, Narishige International Inc., East Meadow, New York, États-Unis). La solution interne contenait 120 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 5 mM de MgATP, 10 mM d'HEPES et 15 mM d'EGTA ; Le pH a été ajusté à 7,2 en utilisant du KOH à température ambiante. Pour les mesures INa et ICa, du Cs+ et du tétraéthylammonium (TEA) ont été ajoutés à la solution de pipette.

Les tests de génotypage TaqMan SNP (Applied Biosystems, Foster City, Californie, États-Unis) ont été utilisés pour effectuer le génotypage ALDH2 de tous les participants humains, tandis que le séquençage direct de l'ADN par PCR a été utilisé pour déterminer les génotypes de nos souris expérimentales dans notre étude. Dans les génotypes humains, les génotypes ALDH2 rs671 GA et AA ont été définis comme porteurs du variant ALDH2 (ALDH2 Vt). L'absence de l'allèle ALDH2 rs671 variant A ou du génotype GG a été définie comme un porteur ALDH2 de type sauvage (ALDH2 Wt). L'ADN génomique a été extrait d'échantillons de sang total contenant de l'EDTA obtenus de chaque participant à l'aide d'un système d'extraction semi-automatisé (Smart LabAssist, Taiwan Advanced Nanotech Inc., Tau-Yuan County, Taiwan) équipé d'une plaque TANBead Blood DNA (Taiwan Advanced Nanotech Inc.). Les échantillons d'ADN ont ensuite été génotypés pour le polymorphisme cible, ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) de chaque gène candidat à l'aide d'un service commercial établi (Genomics BioSci & Tech. Co., Ltd, Taiwan). Les SNP désignés ont été déterminés par discrimination allélique basée sur la PCR en temps réel à l'aide de réactifs pour les tests de génotypage TaqMan SNP (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) en suivant les instructions du fabricant. Des sondes TaqMan ont été utilisées pour examiner ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) dans la présente étude. L'amplification par PCR et la discrimination allélique ont été réalisées à l'aide d'un système de PCR en temps réel ViiA7 (Applied Biosystems). Le réglage de la PCR quantitative a été programmé à 60 ° C pendant 30 s avec une dénaturation initiale pendant 10 min à 95 ° C, suivie de 40 cycles de dénaturation à 95 ° C pendant 15 s supplémentaires et d'annelage à 60 ° C pendant 1 min. La détection des allèles et la discrimination allélique ont été effectuées pendant 1 min à 60 ° C. Les données brutes ont ensuite été analysées à l'aide du logiciel ViiA7 (v1.2.4). Le taux de réussite du génotypage pour l'analyse du SNP cible (ALDH2 Glu487Lys [rs671, G/A]) était > 96,6 % avec un taux de mésappariement de 0,0 %. Pour le génotypage d'ALDH2 chez la souris, l'ADN de souris a été extrait d'échantillons de queue de souris à l'aide d'un kit de génotypage de souris KAPA (KAPA Biosystems). L'extrémité de la queue ne dépassant pas 1 à 2 mm a été digérée dans un volume de 100 μl contenant 88 μl d'eau de qualité PCR, 2 μl de tampon d'extraction KAPA Express 10X et 2 μl d'enzyme d'extraction KAPA Express, à 75 ° C pendant 10 min, suivi de 95 ° C pendant 5 min pour inactiver l'enzyme. La PCR a été réalisée avec 1 μl d'ADN dans 1 × KAPA2G Fast Genotyping Mix et 0,5 μM d'amorces : 5 min de dénaturation à 95 °C, 35 cycles (20 s à 95 °C, 20 s à 60 °C, 30 s à 72 °C ) et extension finale à 72 °C pendant 5 min. Les amorces ALDH2 EG534 (GTTCTCTCCGATGACAGGATCAACTGCTAC) et EG536 (CAGACATTAACACACTGGGCATTTAGGTC). Les fragments de PCR amplifiés par les amorces EG534 ont été séquencés directement en utilisant EG535 (TACGTTCCCGTGGGCGAACTGGTGCCTT)51.

Les données humaines ont été analysées à l'aide du progiciel STATA 14.0 (Stata Corp., College Station, Texas, États-Unis). Les données continues sont présentées sous forme de moyenne ± écart type (SD) et comparées par les tests t de Student, sauf indication contraire. Les valeurs catégorielles, exprimées en nombres et en pourcentages, ont été comparées à l'aide du test du chi carré ou du test exact de Fisher, selon le cas. L'association du polymorphisme ALDH2 (comme ALDH2 Vt) avec les AV cliniques a été évaluée par régression logistique. Nous avons en outre testé si la présence d'ALDH2 Vt modifie l'association entre la consommation d'alcool et les AV ou l'allongement de QTc. Les données animales ont été soumises à des tests t de Student non appariés ou à des tests Mann-Whitney U pour comparer entre 4 % d'EtOH et des souris à régime normal dans la même catégorie de génotype (Wt ou ALDH2 * 2 KI), sur la base d'ECG, de Western blot, d'immuno-confocal, et des données électrophysiologiques ex vivo (path clamp ou cartographie optique). Les analyses ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism 8 (GraphPad, La Jolla, CA, USA). L'analyse statistique était bilatérale et la signification a été fixée à p < 0,05.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les demandes d'accès à l'ensemble de données émanant de chercheurs qualifiés formés aux protocoles de confidentialité des sujets humains peuvent être envoyées au comité d'accès aux données/d'éthique de l'hôpital MacKay Memorial pour les chercheurs (Coordonnées du comité d'examen institutionnel : MacKay Memorial Hospital. Adresse : No. 92, Sec. 2, Zhongshan N. Rd., Taipei City 10449, Taïwan. TÉL : 02-25433535#3486~3488, e-mail : [email protected]). Les chiffres sous-jacents des données sources sont fournis dans les données supplémentaires 1, et des versions non recadrées des transferts sont fournies dans les figures supplémentaires. 11–15. Des données supplémentaires à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant.

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Les travaux de C.-H. Chen et D. Mochly-Rosen La présente étude a été financée par le National Institute of Health, États-Unis, et une subvention de recherche AA11147 a été attribuée à D. Mochly-Rosen. Cette étude a été soutenue par le National Science Council (NSC) (101-2314-B-195-020, 103-2314-B-010-005-MY3, 103-2314-B-195-001-MY3, 101- 2314-B-195-020–MY1), Ministère des sciences et de la technologie (MOST) (103-2314-B-195-006-MY3, 106-2314-B-195-008-MY2, 107-2320-B- 715-002-MY3, 108-2314-B-195-018-MY2, 109-2314-B-715-008, 110-2314-B-715-009-MY1, 110-2320-B-715-002, 111-2314-B-715-013, 111-2628-B-715-001-MY3), Hôpital MacKay Memorial (10271, 10248, 10220, 10253, 10375, 10358, E-102003, MMH-108-127, MMH -110-114, MMH-110-03) et MacKay Medical College (MMC-RD-108-1B-33, MMC-RD-108-2B-02, MMC-RD-109-1B-18, MMC-RD- 110-CF-G001-02, MMC-RD-110-1E-P002, MMC-RD-111-1B-P025, MMC-RD-111-CF-G001-02).

Département de médecine, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwan

An-Sheng Lee, Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Yun-Fang Chen, Wei-Yu Chen, Shih-Wei Wang, Chung-Lieh Hung et Hung-I Yeh

Division de médecine cardiovasculaire, Hôpital universitaire médical de Chine, Taichung, Taïwan

An-Sheng Lee

Institut de génie biomédical, Collège de génie électrique et informatique, Université nationale Yang Ming Chiao Tung, Hsinchu, Taïwan

Yen-Ling Sung & Shien-Fong Lin

Institut universitaire d'optomécatronique biomédicale, Université médicale de Taipei, Taipei, Taïwan

Yen-Ling Sung

Institut universitaire de génomique médicale et de protéomique, Faculté de médecine, Université nationale de Taïwan, Taipei, Taïwan

Szu-Hua Pan et Xuan-Ren Chen

Programme de diplôme en biologie du génome et des systèmes, Université nationale de Taiwan et Academia Sinica, Taipei, Taiwan

Casserole Szu-Hua

Programme de doctorat en médecine translationnelle, Université nationale de Taiwan, Taipei, Taiwan

Casserole Szu-Hua

Division de cardiologie, Départements de médecine interne, Hôpital MacKay Memorial, Taipei, Taïwan

Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Chung-Lieh Hung et Hung-I Yeh

Département de recherche médicale, Hôpital MacKay Memorial, Nouveau Taipei, Taïwan

Shiao-Li Ding, Ying-Jui Lu et Chin-Ling Hsieh

Examen du Département de physiologie, Hôpital MacKay Memorial, Nouveau Taipei, Taïwan

Chuan-Chuan Liu

Heart Rhythm Center and Division of Cardiology, Department of Medicine, Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taïwan

Fa-Po Chung

Département de médecine, Université nationale Yang Ming Chiao Tung, École de médecine, Taipei, Taïwan

Fa-Po Chung

Institut des sciences biomédicales, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwan

Shih-Wei Wang et Chung-Lieh Hung

Département de biologie chimique et des systèmes, Université de Stanford, École de médecine, Stanford, Californie, États-Unis

Che-Hong Chen & Daria Mochly-Rosen

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Rédaction—ébauche originale, ASL; administration de projet, ASL, YJL et CLH (Chin-Ling Hsieh); analyse formelle, YLS et SHP ; conservation des données, KTS et CHS ; validation, SLD et WYC ; logiciel, YFC et SWW ; supervision, CCL et HIY ; rédaction - révision et édition, XRC, FPC et CLH (Chung-Lieh Hung); acquisition de financement, CHC, DMR et CLH (Chung-Lieh Hung); méthodologie, ASL, YLS et SHP ; conceptualisation, CLH (Chung-Lieh Hung) et HIY ; ressources, HIY et SFL ; patch-clamp, ASL; cartographie optique, YLS ; Imagerie immuno-confocale, SHP Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Chung-Lieh Hung ou Hung-I Yeh.

Ce travail a été soutenu par des subventions de recherche du Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan. Déclaration d'intérêt concurrent : CH Chen et D. Mochly-Rosen détiennent des brevets liés à l'activation ALDA-1 de ALDH2*1 et ALDH2*2. L'un des brevets est concédé sous licence à Foresee Pharmaceuticals, une société où D. Mochly-Rosen est consultant. Cependant, la société n'a contribué à aucune des expériences incluses dans l'étude. Les autres auteurs contributeurs n'ont revendiqué aucun conflit d'intérêt concernant la publication de ces résultats.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : George Inglis.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Lee, AS., Sung, YL., Pan, SH. et coll. Une variante commune de l'aldéhyde déshydrogénase 2 * 2 d'Asie de l'Est favorise l'arythmie ventriculaire avec une consommation chronique d'alcool légère à modérée chez la souris. Commun Biol 6, 610 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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Reçu : 25 février 2022

Accepté : 26 mai 2023

Publié: 06 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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